Soutien
Le personnel de la plateforme peut apporter son soutien dans :
- la préparation des protocoles pré-analytiques (fixation, perméabilisation, marquage)
- la mise en place de panel multi-couleurs
- le réglage des matrices de compensation
- l’élaboration des protocoles d’analyse sur les différents cytomètres
- le passage des échantillons sur les cytomètres (analyse ou tri)
- l’aide à la ré-analyse des données et à l’exploitation des résultats
La cytométrie en flux est utilisée couramment dans de nombreux domaines comme l’hématologie, l’immunologie, la pharmacologie et la cancérologie. Elle peut même apporter une aide en océanologie avec l’étude du phytoplancton. Diverses applications peuvent ainsi être envisagées.
Savoir-faire
Après analyse d’un échantillon « mère » et paramétrage des conditions de tri en fonction des caractéristiques des cellules (morphologie et fluorescences), il est possible de récupérer une ou plusieurs populations cellulaires « filles » très pures (de l’ordre de 95-99%). La viabilité des cellules étant peu affectée par le tri, celles-ci peuvent être utilisées pour des expériences de culture cellulaire (clonage, expansion…) ou des analyses moléculaires en aval.
L’utilisation de clusters de différenciation adaptés à l’analyse permet d’identifier différentes populations lymphocytaires au sein d’un échantillon.
Après fixation des cellules et perméabilisation à l’éthanol 70%, la quantité d’ADN est mesurée par ajout d’Iodure de Propidium et analyse de la fluorescence au sein des singulets de cellules. Cette analyse permet ainsi de déterminer dans quelle phase du cycle cellulaire se trouve la cellule (G0/G1, S et G2/M). Il est également possible d’estimer la ploïdie des cellules en ajoutant une référence (cellules de ploïdie connue et en comparant les intensités de fluorescence obtenues.
L’ajout de colorants CellTrace ou CFSE permet le suivi des générations cellulaires. Les colorants étant retenus dans les cellules vivantes, la quantité de colorant dans chaque cellule est réduite de moitié à chaque division cellulaire permettant ainsi le suivi du nombre de division ou de générations.
L’utilisation de billes multiplexées permet l’identification et le dosage des cytokines directement par cytométrie en flux avec l’aide d’une courbe étalon.
L’utilisation de sonde Annexine V permet d’identifier les cellules en cours d’apoptose. Couplé à l’utilisation d’Iodure de Propidium, il est possible d’identifier les cellules apoptotiques et les cellules nécrotiques.
Des sondes de viabilité permettent de quantifier les cellules vivantes et les cellules mortes par principe d’exclusion ou de rétention. Dans cet exemple, l’Iodure de Propidium est utilisé en tant que sonde d’exclusion sur des cellules fraiches pour marquer les cellules mortes.
L’utilisation de sonde sensible à la teneur en radicaux libres dans les cellules montrent des variations d’intensité de fluorescences.
L’ajout de microbilles fluorescentes va permettre de mesurer le pourcentage de billes phagocytées par chaque cellule.
En analysant la fluorescence naturelle des grains de pollen, il est possible d’observer des différences.
Après marquage de l’ADN des cellules et après calibration de l’appareil, il est possible d’évaluer le nombre de micro noyaux présents dans chaque cellule.
L’analyse directe d’échantillons d’eau de mer, permet de distinguer différentes populations planctoniques en fonction des variations naturelles de fluorescences.
Formations
Depuis 2022, 7 doctorants et 6 ingénieurs – chercheurs ont été formés à l’utilisation des cytomètres en flux et ont réalisé leurs analyses en autonomie sur les équipements de la plateforme.
ISOCELL dispense chaque année une initiation à la cytométrie en flux avec des cours magistraux, des travaux dirigés et des travaux pratiques dans le cadre du BUT 2e année Génie biologique parcours Biologie médicale et biotechnologie de Caen. La plateforme est également impliquée dans des formations sous forme de visite ou de travaux pratiques (stage de 3e, 4e année filière internat en sciences pharmaceutiques, Master Sciences de la mer et Master Biologie santé) de l’université de Caen Normandie.
Communication scientifique
La plateforme de cytométrie participe à l’animation scientifique de l’US Platon et est régulièrement associée à des posters ou des présentations orales dans des congrès nationaux et internationaux. Elle est également citée dans les co-auteurs ou remerciée dans des publications dans des revues internationales. Les conditions de citation de la plateforme sont indiquées dans le règlement intérieur.